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文献速递丨naica®微滴芯片数字PCR系统精准定量-艾滋治愈曙光“HIV潜伏病毒

自从引入联合抗逆转录病毒疗法 (ART) 以来,HIV-1感染已从一种致命疾病转变为一种可控制的慢性疾病。然而,虽然ART可有效抑制个体的病毒复制,但它并不能治愈HIV-1感染。这是由于患者体内存在一个潜伏病毒库(latent resservoir),其中包含一小部分具有复制能力的完整原病毒(约占1-5%),在ART停止后为病毒复制提供“燃料”。因此,科学家若想通过消除该病毒库达到HIV-1治愈的目的,就不得不对这些完整原病毒进行准确评估。但是,接受ART治疗的患者可能具有载量非常小的完整潜伏病毒库,在有限的血液采样中进行检测,可能会遗漏这些潜在储库。


▲图源:网络(侵删)

在过去的几年里,已经出现了几种基于PCR与二代测序 (NGS) 相结合来检测病毒库的方法。比如基于双重dPCR方法来量化HIV-1患者的完整原病毒,即IPDA(intact proviral DNA assay)方法,该方法通过双重实验检测HIV-1基因组中的PSI和ENV两个靶点。另一种常见方法是Q4PCR,其在HIV-1全长测序方案中引入了四重qPCR,在全长测序之前评估HIV-1基因组的完整性。尽管这些方法提高了检测灵敏度并且可以提供全长的 HIV-1序列,但其成本效益不高,需要多步人工操作且耗时较长。

比利时根特大学、根特大学数字PCR联盟、艾滋病毒治疗研究中心等科学家近日在知名期刊《Methods》上发表了一篇HIV-1病毒库研究相关文献,文章对IPDA方法和Q4PCR方法进行集成,并在naica®微滴芯片数字PCR系统进行验证,该方法增加了IPDA 方法检测HIV-1的靶点数量,提高了检测灵敏度,实现对潜伏病毒库的精准定量。


研究方法:

结合IPDA和Q4PCR方法,设计基于naica®微滴芯片数字PCR系统的三重数字PCR实验。

☑ PSI靶点-FAM蓝色探针标记

☑ ENV靶点-HEX绿色探针标记

☑ GAG靶点 & POL靶点-Cy5红色探针标记

▲ 靶点对应的基因组位置图

研究结果:

☑ 使用J-Lat 8.4细胞系(每个细胞含有1拷贝的HIV-1基因组)进行单重实验,并测定naica®微滴芯片数字PCR系统三重试验的性能,结果显示定量结果和理论值一致,重复性好;各靶标阴阳性微滴区分良好。

▲ 对阳性对照J-Lat 8.4细胞的拷贝数进行量化-设定PSI、ENV、GAG/POL单重检测

及IPDA和三重等多重实验,并对DNA剪切情况进行校正(DSI)


☑ 使用naica®微滴芯片数字PCR系统直接定量来自HIV-1患者的五个PBMC样本,这些样本病毒载量较低,且均经过ART治疗,检测结果显示5个患者均检出了HIV-1。此外,发现一个比较有趣的现象,在患者SLR_26样本中几乎没有检测到ENV且PSI也只有非常低的信号,该结果表明PSI和ENV序列中可能存在缺失或突变,如果只检测这两个靶点的话,该病人可能被判读为HIV-1阴性。幸运的是,使用naica®微滴芯片数字PCR系统设计的三重实验,GAG或POL基因正常检出,表明该样本含有HIV-1。

▲ 使用naica®微滴芯片数字PCR系统对5个HIV-1病人的PBMC(每百万个)进行定量

文章结论:

通过naica®微滴芯片数字PCR系统对HIV-1患者潜伏病毒库进行了量化,相较于传统方法增加了亚基因组区域的检测数量,提高了对潜伏病毒库的检测的灵敏度,降低结果误判的可能性,且该方法甚至可以在未来开发的5色或6色的数字PCR系统中进一步放大。

原文链接如下:https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2021.05.006


单位简介:

根特大学(Ghent University),简称UGent,由荷兰国王威廉一世于1817年创办,迄今已有200多年历史,是比利时学术排名第一的世界顶尖研究型大学,一直以其极高的学术水平享誉全球,2020年世界大学学术排名中位列第66名,根特大学校友中诞生了4位诺贝尔奖得主。

随着数字PCR技术的发展,根特大学已成立数字PCR联盟,该联盟致力于开发数字PCR检测和数据分析工具,同时该平台还会不定期举办数字PCR培训课程,帮助广大学子及专业人士更好的了解和应用数字PCR技术。


想了解更多关于该联盟的信息可点击下方链接:


naica®微滴芯片数字PCR系统

法国Stilla Technologies公司的naica®微滴芯片数字PCR系统在进行核酸检测时具有独特的优势。该系统利用cutting-edge微流体创新型芯片—Sapphire芯片(或高通量Opal芯片)作为数字PCR过程的耗材。样品通过毛细通道网格以30,000个微滴的形式进入2D芯片中。3色荧光检测仪器,整个流程只需要2.5小时,并可进行数据的质控和结果追溯分析,获得的数据真实可靠。